ADC生物分析面临的挑战和检测手段
随着蛋白质工程的进展，极大推动了ADC药物的开发，同时也带来生物分析挑战，ADC的组分复杂，体内分解代谢和生物转化难以摸透，因此急需成熟可靠的ADC生物分析方法为临床前/临床研究提供数据信息。本文探讨抗体-药物偶联物（ADC）的生物分析策略，并综述用于定量和表征ADC的生物分析方法的最新进展。
01
ADC的EPR效应和体内作用过程
众所周知，肿瘤具有EPR效应（enhanced permeability and retention effect），即实体瘤的高通透性和滞留效应。正常组织中血管壁结构完整紧密，有淋巴回流。而肿瘤组织诱导下产生的血管间隙比较大，并且血管丰富，基本上没有淋巴回流，结构上的完整性比较差，血流通过这里的时候大分子可以扩散出来，进入肿瘤组织间隙。
因此ADC静脉给药进入血液循环，通过ERP效应进入肿瘤组织，然后通过内化作用，特异性的胞吞、胞饮，进入细胞内部，通过溶酶体的转运，进入溶酶体内，在溶酶体酶的作用下裂解释放毒素，通过DNA损伤或抑制微管蛋白合成等使细胞死亡。细胞死亡以后，毒素还能够直接通过邻近的细胞膜，直接进入到邻近细胞内，起到旁观者效应（bystand effects）的作用，直接杀伤邻近细胞。
02
ADC生物分析面临诸多挑战
2.1 ADC成分复杂，行为各异，无法通过单一方法分析
ADC中的偶联接头通常分为可裂解和不可裂解，它们在生物系统中的行为完全不同，并在体内释放毒素形式也不同。具体而言，可裂解接头（例如，缬氨酸-瓜氨酸二肽、肼和二硫键）特异性的对癌细胞细胞内特性敏感，例如某些蛋白酶、pH和谷胱甘肽的表达，以此实现毒素选择性释放。相比之下，不可裂解的接头不含特异性释放机制，依赖于ADC内化后的细胞内蛋白水解。从分析的角度来看，虽然具有可裂解接头的ADC在生物系统中释放游离毒素，但具有不可裂解接头的ADC通常会释放ADC完全降解后的产物——活性毒素-接头-氨基酸部分。因此，应针对不同的分析物，要施行不同的生物分析方法。
2.2 ADC体内持续生物转化，干扰精确度
由于内环境、偶联位点、接头的不稳定性和复杂性，ADC体内生物转化（如毒素脱落、蛋白质质量增加/损失和有效载荷代谢）经常发生。这种生物转化可能会降低疗效并增加脱靶毒性。尽管一些新的工程技术（例如胱氨酸工程、非天然氨基酸工程、酶介导的偶联、肽标签工程、新型异双功能试剂）用位点特异性方式生产出更均匀和稳定的ADC，但体内生物转化仍可能持续存在。若ADC上的检测位点发生生物转化，会干扰生物分析方法的准确性。
2.3 体内代谢动态变化，测定复杂且间接
在临床的时候不可能测肿瘤组织中药物的浓度，只能测定血循环中ADC的浓度。如何通过有限的数据去反应最终的药效，绝对是临床PK模型的挑战。药物抗体比（DAR）是描述与抗体偶联的有效载荷数量的重要参数，但DAR物种可以在体内动态变化，这给生物分析带来了额外的挑战，增加了ADME（吸收、分布、代谢和排泄）研究的复杂性。
2.4 游离药物测定要求高灵敏度
03
ADC生物分析方法有哪些？
2013年一份美国药物科学家协会的文件建议，在ADC药物开发早期阶段应测量以下成分以进行评估：总抗体，ADC和游离毒素（表1）。除了这三个基本的评估成分外，根据ADC分子的结构和毒素的特性，还可以额外地测定结合型毒素、体内DAR值、免疫原性等，以便更好地了解ADC的药代动力学和ADME。LC-MS/MS通常用于小分子游离毒素分析；配体结合测定（LBA）或LC-MS方法用于定量总抗体和ADC。
3.1 药物早期开发阶段的定量和药代动力学评估
在药物开发筛选的时候，通常需要快速、高通量和高效的药代动力学表征，指导我们避免和改进药物一些不好的特质。
对于动物研究中的人源化单克隆抗体（mAb）或ADC，可以使用LBA或LC-MS测定形式实现通用定量方法；总抗体的通用LBA方法通常用于初始药代动力学评估，一般抗人免疫球蛋白抗体或配体作为捕获和/或检测试剂，应用LBA方法定量ADC需要使用针对特定毒素的选择性试剂。抗毒素抗体的生成非常耗时，并且在同时评估多个不同接头变体的毒素优化期间可能很困难。
对于具有可裂解接头的ADC，混合LBA–LC-MS/MS方法仅使用一种捕获试剂即可测量总抗体和ADC浓度。它利用酶释放肽或毒素，这些肽或毒素可以通过LC分离，并通过MS使用多反应监测模式进行检测。与LBA不同，基于质谱的方法对捕获试剂选择性/特异性的要求通常不那么严格，但质谱方法依赖于替代检测肽。通常选择人免疫球蛋白框架特有的几种片段可结晶（Fc）区常见肽作为动物研究的检测肽。
发现和早期开发工作的生物分析方法的鉴定可以遵循实用性，通常在样品分析之前对任何定量方法的准确性、精密度和选择性进行最低限度的评估。
3.2 毒理学或临床研究阶段的检测手段
对于在毒理学或临床研究中进行评估的候选药物，需要一种经过验证、稳健且高通量的生物分析方法，以满足相关监管机构的期望，以支持此类研究和长期样品检测。
为了支持临床研究，对于使用人或人源化抗体支架的ADC，通常需要采用高选择性捕获抗体的方法在人基质中展示必要的灵敏度和选择性。对于LBA，通常需要一对抗特异型抗体。LBA-LC-MS方法只需要一种具有蛋白型肽（通常来自互补性决定区）的捕获抗体即可达到所需的选择性。试剂采集应尽早进行，以便进行临床检测开发。尽管多种方法可以解决生物分析挑战，但应仔细考虑项目生命周期的每个阶段以及整体生物分析策略，最终在这种更大背景下进行生物分析方法的选择。
简而言之，LBA具有高通量和低设备成本的特点，在几种已获批准的ADC（表1）的药代动力学评估中发挥了关键作用。然而，当我们对结构和生物转化信息更感兴趣，或者没有关键试剂时，LBA-LC-MS方法具有优势。
3.3 新的生物分析方法——高分辨率质谱（HRMS）能够识别ADC生物转化
如前所述，ADC具有复杂的结构，会产生众多的生物转化。完整的HRMS方法可以为替代分析物方法提供补充信息，从而为药物发现和开发提供信息。与自下而上的替代肽方法相比，完整分析方法可检测大分子的整体或组分（例如，部分蛋白水解方法中释放的片段抗原结合区域）。完整HRMS定量的灵敏度显著提高。在体内猴药代动力学研究中，与替代肽法相比，完整分析方法可以提供等效的定量结果。
尽管替代分析物测定法测量了可通过酶释放的总毒素，但完整的HRMS测定揭示了ADC随时间推移的结构变化。因此，使用完整的HRMS进行定量可以进一步评估以前遗漏的单个分析物，并可作为更全面地表征ADC药代动力学和代谢的补充工具。
小结
与传统的大分子或小分子药物相比，ADC的生物分析既复杂又具有挑战性，需要创新的生物分析技术来克服生物转化、ADME和组织样品分析等方面的挑战。成熟的生物分析策略对于ADC的临床成功至关重要。随着技术和仪器的发展，LBA或混合LBA-LC-MS等生物分析方法继续作为强大可靠的工具，同时HRMS等一些新的手段也在慢慢成型。这些工具伴随着我们从药物开发的早期阶段走到实验室毒理学和临床研究，有助于我们更好地分析ADC的药代动力学（PK）、代谢和生物分布，掌握ADC的暴露、体内分解代谢和生物转化，把握ADC的功效和毒性。PK研究可以指导新药设计，优化给药方案，改进药物剂型。但PK只是提供数据和参考，需要和药效、毒理、副作用等联合起来，才能得到比较优质的给药方案。